Cámara de dióxido de carbono: optimización de un método para eutanasia de ratas de laboratorio

Persia, FA ; Vera, ME ; Mariani, ML ; Penissi , A
Instituto de Histología y Embriología. FCM

Postulado a premio Inv. Joven en Cs.Básicas

Introducción:

        Eutanasia significa “buena muerte” (del griego eu=buena; thanatos =muerte). En los laboratorios de investigación científica, donde se trabaja habitualmente con pequeños roedores como reactivo biológico, el método más ampliamente utilizado para eutanasia es la inhalación de agentes químicos como el éter etílico. Este método presenta serias desventajas debido a que sus vapores son muy inflamables frente una fuente de ignición, resultando altamente estresante para el animal, además de ser irritante para la piel y las mucosas, tanto de los animales de experimentación como de los operarios. El dióxido de carbono (CO2), en cambio, es un gas seguro, no explosivo, inocuo para las vías respiratorias, fácil de generar, que no provoca dolor ni estrés y que produce un efecto anestésico con rápida pérdida de conciencia seguido de un efecto eutanásico. Sin embargo, los tubos de CO2 no representan una opción económica para laboratorios individuales.

Considerando estos antecedentes, el objetivo del presente trabajo fue optimizar un sistema seguro, económico, rápido, sencillo y reproducible para sacrificar pequeños roedores, basado en la producción de CO2 mediante una reacción química a partir de ácido acético y bicarbonato de sodio.

Materiales y métodos:              

Animales:

        Se utilizaron 30 ratas machos adultas de la cepa Wistar, mantenidas en el bioterio del Instituto de Histología y Embriología (IHEM) bajo estricto control de alimentación, temperatura (22±1ºC) y períodos de luz/oscuridad (luz de 6:00 a 18:00 y oscuridad de 18:00 a 6:00). Las ratas fueron sacrificadas para experimentos posteriores que no formaron parte de este trabajo.

Reactivos:

        Solución de bicarbonato de sodio al 8% (Cofarmen) y ácido acético glacial (Tetrahedron).

Materiales:

        Embudo de filtración (EAB), kitasatos (Pyrex), tubuladura de goma, desecador (Pyrex) de 3 litros y tubo con robinete (material de boro silicato).

Procedimiento:

        El principio básico de desarrollo del sistema consistió en la generación de CO2 a partir de una reacción química entre una solución al 8% de bicarbonato de sodio puro (SBS) y ácido acético glacial (AA), en la cual el gas generado fue utilizado para sacrificar al animal.

H3CCOOH + NaHCO3 à CO2 + H2O + H3CCOONa

El sistema empleado se esquematiza en la Figura 1. Se colocaron 40 ml de AA en un kitasato (c) antes de añadir la solución SBS, manteniendo cerrado el robinete del tubo (b).  Posteriormente se llenó (b) con SBS y luego se abrió el robinete, dejando pasar la solución SBS que resultó en la producción del CO2 (c) y que se evidenció como burbujas en un segundo kitasato (f). Este último tuvo la función de filtro, neutralizando cualquier vapor ácido que se pudiese haber generado en la etapa anterior.

Se evaluó el volumen de SBS necesario para sacrificar cada animal. La cantidad óptima de AA utilizado fue obtenida a partir de la reacción estequiométrica entre bicarbonato de sodio y ácido acético. Se midió, además, el tiempo de pérdida de conciencia y muerte de los animales.

Los resultados se expresaron como media ± SEM.

Resultados:

Cantidades de reactivos utilizados:

        La cantidad de SBS que se usó para sacrificar una rata fue de 187 ± 40 ml, colocada de manera individual en la cámara, estando la cámara saturada con CO2, para lo cual se utilizaron 250 ml de SBS (Figura 2A).            

Medición del tiempo de pérdida de conciencia y muerte de los animales:

        Se pudo observar que los animales una vez colocados en la cámara perdían la conciencia a los 50 ± 15 segundos, muriendo a los 330 ± 15 segundos (5`30``) con cámara pre-saturada con CO2. La muerte se verificó a través del cese de los latidos cardíacos del animal. (Figura 2 B).

Conclusión:

       El presente trabajo permitió desarrollar y optimizar una metodología segura, económica, rápida, sencilla y reproducible para sacrificar animales de experimentación sin sufrimiento ni dolor. Este método podría representar una alternativa útil como procedimiento eutanásico para pequeños animales de laboratorio.

Imagen 1

A, Volumen de bicarbonato de sodio. Solución de bicarbonato de sodio (SBS) requerida para sacrificar una rata. B, Pérdida de conciencia y muerte. Pérdida de conciencia y tono muscular (PC) y muerte de la rata (n=30). Tiempo medido en segundos.

Imagen 2

Representación esquemática del sistema: (a) embudo de filtración, (b) tubo con robinete, (c) kitasato, (d) agitador magnético, (e) tubuladura de goma, (f) kitasato, (g) cámara principal.


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Comentarios

1) La formación de CO2 a partir del bicarbonato de sodio y ácido acético glacial tiene el inconveniente que algo de ácido acético libre queda después de la reacción (la constante de equilibrio no tiende a infinito). El ácido acético es altamente irritante para las mucosas y muy volátil a la temperatura ambiente. Su inhalación es un estímulo estresante importante para los animales. ¿Consideraron los autores que además del CO2 producido haya existido en la cámara principal una cantidad significativa del ácido acético y por lo tanto los animales hayan sido sacrificados con estrés? 2) ¿Qué medici

Escrito por EO Alvarez - May 31st 2010, 20:09

2) ¿Qué mediciones post-morten realizaron los autores en los animales sacrificados con este método, como análisis histológico de las vías respiratorias y pulmones, que permitan cuantitativamente descartar una agonía estresante considerando que la muerte tardó aproximadamente 5.5 min en llegar?

Escrito por EO Alvarez - May 31st 2010, 20:11

Estimado EA Alvarez con respecto a tu primer pregunta, el sistema consta de un quitasato pequeño de 500ml el cual contiene una solución alcalina, en la cual se hace buebujear el gas generado en la reacción quimica, neutralizando cualquier vapor ácido. Con respecto a tu segunda pregunta no hemos hecho ningun analisis post-mortem, el cual se hara proximamente seguramente, hay que tener en cuenta que es un sistema experimental al cual faltan varios detalles por terminar, siempre nos basamos en bibliografia para decir que el dioxido de carbono no tiene efectos adversos. muchas gracias y espero ha

Escrito por FA Persia - Jun 1st 2010, 06:58

Estimado Dr. Álvarez: En relación a su pregunta acerca de qué evidencias teníamos con respecto a si se produjo estrés en los animales debido al carácter irritante del ácido acético, le comento que además de colocar una solución alcalina para neutralizar los vapores ácidos que se desprenden en la cámara de reacción, nosotros extrajimos la tráquea de los animales luego del sacrificio para realizar el análisis histológico de la misma. Continúa en el próximo comentario.

Escrito por Mariano Vera - Jun 17th 2010, 11:43

La evaluación microscópica nos permitió demostrar integridad y conservación de la estructura normal del epitelio traqueal. No se observaron alteraciones de la morfología ciliar ni de las células caliciformes productoras de mucus. Estas células se apreciaron pletóricas y no se observó mucus luminal, lo que nos indica que no se ha producido un efecto irritante sobre la mucosa, puesto que de otro modo las mismas se observarían sin su morfología granular típica...

Escrito por Mariano Vera - Jun 17th 2010, 11:46

... y se evidenciaría presencia de mucus en la luz traqueal. Por otra parte, aprovecho para comentarle que el método fue evaluado por el médico veterinario Dr. Roberto Mera y Sierra (fundamentalmente desde el punto de vista del cuidado animal), quien lo consideró apropiado para sacrificar pequeños animales de laboratorio.

Escrito por Mariano Vera - Jun 17th 2010, 11:47

Hola, necesitaba consejo sobre este tema. Soy de un centro de animales y dadas las necesidades nutricionales de ciertos carnívoros se sacrifican a diario pequeños roedores y aves, y nos gustaría evitar el dolor a los animales y a los cuidadores ante una rutina tan dura para ambos. Debido a restricciones necesitamos hacer algo como esto de la forma más barata posible para que nos permitan usarlo. ¿Cuánto es el coste estimado de la química y cómo podemos crearlo de forma artesanal? Muchas gracias.

Escrito por No_pain - Feb 26th 2013, 13:21